Desenvolvimento de técnica de RT-qPCR para detecção de hantavírus amazônicos

Abstract

Resumo: A Síndrome Pulmonar por Hantavírus é uma zoonose emergente, muitas vezes fatal causada por hantavírus (família Bunyaviridae). A transmissão para humanos ocorre através do contato com excreta de roedores silvestres infectados. No Brasil, o diagnóstico para hantavírus é baseado em técnicas imunológicas, enquanto que RTPCR é utilizado como suporte laboratorial. O RT-qPCR tem sido utilizado no diagnóstico molecular de diversos agentes etiológicos, principalmente devido à geração rápida de resultados, junto com elevada sensibilidade e especificidade. No entanto, não há nenhum ensaio de RT-qPCR desenhado para detectar os hantavírus circulantes na Amazônia brasileira. Portanto, este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um ensaio de RT-qPCR controlado internamente para detectar esses hantavírus. Um conjunto de iniciadores e sonda foi desenhado a partir de uma região do gene N consenso, utilizando sequências dos hantavírus VLN, VANAJ, VCAS e VRIOM. Esta mesma região também foi clonada em plasmídeos e transcrita in vitro para RNA, o qual foi diluído em padrões de concentração conhecida. O RNA de bacteriófago MS2 foi adiconado em todas as amostras antes da extração e foi detectado em conjunto com hantavírus como um controle exógeno numa reacção duplex. Para avaliar os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia do protocolo, foram testadas 127 amostras (de sangue ou soro), dividindo-se em três grupos: hantavírus positivo, hantavírus negativas e positivas para outros agentes patogênicos. Os resultados foram comparados aos obtidos por semi-nested RTPCR. A eficiência de RT-qPCR ficou em cerca de 100% e o limite de detecção foi de 0,9 cópias / mL de RNA. Não houve amplificação de ambos, as amostras negativas ou as amostras positivas de outros agentes patogénicos. O RT-qPCR foi mais sensível do que a semi-nested RT-PCR, sendo capaz de detectar três amostras não detectadas pelo semi-nested RT-PCR. A sensibilidade, especificidade e acurácia RT-qPCR valores foram de 92,5%, 100% e 97,63%, respectivamente. Assim, o ensaio de RT-qPCR desenvolvido foi específico, sensível e capaz de gerar resultados em duas horas, o que o torna um poderoso instrumento em aplicações de diagnóstico, vigilância e investigação de hantavirose na região da Amazônia brasileira e, possivelmente, para outros hantavírus