Análise genotípica de cepas de noravírus provenientes de Manaus, Amazonas, no periódo de 2010-2014

Abstract

Resumo: Mundialmente, os norovírus (NoV) constituem uma das principais causas de gastrenterite aguda (GA). Durante os últimos anos, têm-se observado a ascensão desses vírus como agentes causadores de diarreia, sendo atualmente a segunda maior causa de GA viral em crianças e o principal responsável por surtos de diarreia não-bacterianos. O objetivo deste estudo foi realizar a genotipagem e caracterização filogenética dos NoV detectados em amostras fecais de crianças com GA provenientes da cidade de Manaus, Amazonas, durante o período de janeiro de 2010 a dezembro de 2014. Neste trabalho, foram analisadas amostras fecais positivas para NoV pelo ensaio imunoenzimático (EIE). Primeiramente, foi realizada a Reação em Cadeia da Polimerase Precedida de Transcrição Reversa (RT-PCR) para as regiões B da polimerase e D do capsídeo viral, utilizando os iniciadores Mon 431/432/433/434 e Cap C, D1 e D3, respectivamente. Vinte por cento das amostras caracterizadas como genótipo GII.4 foram testadas e sequenciadas também com os iniciadores EVP2F/EVP2R específicos para a região P2 do capsídeo viral. Nas amostras com genótipos discordantes quando comparadas as regiões da polimerase e do capsídeo (D), sugestivas de recombinação, foi realizada uma PCR para sequenciamento da região de junção da ORF1-ORF2 utilizando os iniciadores Mon 431 e G2SKR. As análises filogenéticas foram realizadas por MáximaVerossimilhança utilizando-se o programa IQTree v.1.3.0 com 1000 réplicas de bootstrap. Edições nas árvores filogenéticas foram feitas com o programa FigTree v.1.4.2 e as análises dos epítopos da região P2 no programa MEGA 6. As análises de recombinação foram realizadas com as configurações padrões do programa SimPlot (v.3.5.1). Durante os anos de 2010 a 2014, os NoV foram detectados em 33,1% (349/1053) das amostras testadas pelo EIE. Dentre estas, 250 foram testadas por RT-PCR e 75,6% (189) amplificaram por pelo menos uma região do genoma, permitindo a genotipagem. A análise filogenética demonstrou os seguintes genótipos: GII.Pe/GII.4 Sydney_2012, GII.P4/GII.4 New Orleans_2009, GII.P8/GII.8, GII.P12/GII.12, GII.P15/GII.15, GI.P5/GI.5, GII.P4_US95_96/NG, além das cepas recombinantes GII.P7/GII.6, GII.P22/GII.5, GII.Pg/GII.1, GII.Pg/GII.12. O genótipo mais frequente foi o GII.4, na forma de suas variantes Sydney_2012 e New Orleans_2009, as quais foram responsáveis por 52,4% (99/189) dos casos. Nos anos de 2010 e 2011, observouse a circulação da cepa GII.P4/GII.4 New Orleans_2009 em maior frequência. A partir de junho de 2012, essa cepa foi substituída pela cepa Sydney_2012, a qual predominou até o final do estudo em 2014. A análise da região P2 demonstrou que nove cepas New Orleans_2009 apresentavam mudanças aminoacídicas no aminoácido (AA) 294 localizado no epítopo A e duas no AA 413 no epítopo E. Nas cepas Sydney_2012 foram identificadas cinco mudanças nos AA nos epítopos antigênicos, são elas: 297 e 372 (epítopo A), 340 (epítopo C), 393 (epítopo D) e 412 (epítopo E). Ressalta-se a importância de dar continuidade a estudos epidemiológicos e moleculares como este, a fim de se monitorar a incidência desse patógeno na população, bem como identificar os genótipos circulantes, uma vez que os NoV sofrem frequentemente eventos de mutação e recombinação.